1、培養基配方的選定
同一種培養基的配方在不同著作中常會有某些差別。因此，除所用的是標準方法，應嚴格按其規定進行配制外，一般均應盡量收集有關資料，加以比較核對，再依據自己的使用目的，加以選用，記錄其來源。
2、培養基的制備記錄
每次制備培養基均應有記錄，包括培養基名稱，配方及其來源，和各種成份的批號，最終pH值、消毒的溫度和時間，制備的日期和制備者等，記錄應復制一份，原記錄保存備查，復制記錄隨制好的培養基一同存放、以防發生混亂。
3、培養基成分的稱取
培養基的各種成分必須精確稱取并要注意防止錯亂，最好一次完成，不要中斷。可將配方置于傍側，每稱完一種成分即在配方處做出記號，并將所需稱取的藥品一次取齊，置于左側，每種稱取完畢后，即移放于右側。完全稱取完畢后，還應進行一次檢查。
4、培養基各成份的混合和溶化
培養基所用化學試劑均應是化學純的。使用的滅菌鍋不得為銅鍋或鐵鍋，以防有微量銅或鐵混入培養基中，使細菌不易生長。最好使用不銹鋼鍋加熱溶化，可放入大燒杯或大燒瓶中置高壓蒸汽滅菌器或流動蒸汽消毒器中蒸煮溶化。在鍋中溶化時、可先用溫水加熱并隨時擾動、以防焦化、如發現有焦化現象、該培養基即不能使用，應重新制備。待大部分固體成分溶化后，再用較小火力使所有成分完全溶化，直至煮沸。如為瓊脂溶化，用另一部分水溶化其它成分，然后將兩溶液充分混合。在加熱溶化過程中，因蒸發而丟失的水分，最后必須加以補足。
5、培養基pH的初步調正
因培養基在加熱消毒過程中、pH會有所變化，培養基各成分完全溶解后，應進行PH的初步調正。例如，牛肉浸液約可降低pH0.2，而腸浸液pH卻會有顯著的升高。因此，對這個步驟，操作者應隨時注意探索經驗、以期能掌握培養基的最終PH，保證培養基的質量。PH調整后，還應將培養基煮沸數分鐘，以利培養基沉淀物的析出。
6、培養基的過濾澄清
液體培養基必須絕對澄清，瓊脂培養基也應透明無顯著沉淀，因此，須要采用過濾或其它澄清方法以達到此項要求。一般液體培養基可用濾紙過濾法，濾紙應折疊成折扇或漏斗形，以避免因液壓不均勻而引起濾紙破裂。
瓊脂培養基可用清潔的白色薄絨布趁熱過濾。亦可用中間夾有薄層吸水棉的雙層紗布過濾。新制肉、肝、血和土豆等浸液時、則須先用絨布將碎渣濾去，再用濾紙反復過濾。如過濾法不能達到澄清要求、則須用蛋清澄清法。即將冷卻至55~60°C的培養基放入大的三角燒瓶內，裝入量不得超過燒瓶容量的1/2，每1000ml培養基加入1~2個雞蛋的蛋白，強力振搖3~5分鐘，置高壓蒸汽滅菌器中、121°C加熱20分鐘、取出趁熱以絨布過濾即可。
7、培養基的分裝
培養基的分裝，應按使用的目的和要求，分裝于試管、燒瓶等適當容器內。分裝量不得超過容器裝盛量的2/3。容器口可用墊有防濕紙的棉塞封堵，其外還須用防水紙包扎（現試管一般多有用螺旋蓋者）。分裝時最好能使用半自動或電動的定量分裝器。分裝瓊脂斜面培養基時，分裝量應以能形成2/3底層和1/3斜面的量為宜。分裝容器應預先清洗干凈并經干烤消毒，以利于培養基的徹底滅菌。每批培養基應另外分裝20ml培養基于一小玻璃瓶中，隨該批培養基同時滅菌，以為測定該批培養基最終pH之用。
8、培養基的滅菌
一般培養基可采用121°C高壓蒸汽滅菌15分鐘的方法。在各種培養基制備方法中，如無特殊規定，即可用此法滅菌。
某些畏熱成分，如糖類，應另行配成20%或更高的濃液，以過濾或間歇滅菌法消毒，以后再用無菌操作技術、定量加于培養基。明膠培養基亦應用較低溫度滅菌。血液、體液和抗生素等則應以無菌操作技術抽取和加入于經冷卻約50°C左右的培養基中。
瓊脂斜面培養基應在滅菌后立即取出，冷至55℃-60℃時，擺置成適當斜面，待其自然凝固。
9、培養基的質量測試
每批培養基制備好以后，應仔細檢查一遍，如發現破裂、水分浸入、色澤異常、棉塞被培養基沾染等、均應挑出棄去。并測定其最終pH。
將全部培養基放入36±1°C恒溫箱培養過夜，如發現有菌生長，即棄去。
用有關的標準菌株接種1~2管或瓶培養基，培養24~48小時，如無菌生長或生長不好。應追查原因并重復接種一次，如結果仍同前，則該批培養基即應棄去，不能使用。
10、培養基的保存
培養基應存放于冷暗處，最好能放于普通冰箱內。放置時間不宜超過一周，傾注的平板培養基不宜超過3天。每批培養基均必須附有該批培養基制備記錄副頁或明顯標簽。

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